嗜衣原體通用探針法熒光定量PCR檢測試劑盒

注意事項：1．基礎程序；2．擴增溫度和延伸溫度；3．反應時間；4．循環次數；5．PCR 反應液的配制；6．PCR技術的基本原理；7．PCR的反應動力學；8．PCR擴增產物；9．PCR反應體系與反應條件。

儲存條件：

14℃或－20℃樣品收集、處理及保存方法
1. 血清：使用不含熱原和內毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液后，3000 轉離心10 分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉離心30 分鐘取上清。
3. 細胞上清液：3000 轉離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉離心10 分鐘取上清。
5. 保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

探針法：
嗜衣原體通用探針法熒光定量PCR檢測試劑盒aqMan 探針是一種寡核苷酸探針，它的熒光與目的序列的擴增相關。它與目標序列上游引物和下游引物之間的序列配對。熒光基團連接在探針的5’ 末端，而淬滅劑則在3’ 末端。當完整的探針與目標序列配對時，熒光基團發射的熒光因與3’ 端的淬滅劑接近而被淬滅。但在進行延伸反應時，聚合酶的5’ 外切酶活性將探針進行酶切，使得熒光基團與淬滅劑分離。隨著擴增循環數的增加，釋放出來的熒光基團不斷積累。因此熒光強度與擴增產物的數量呈正比關系。相對于染料法,Taqman探針法具有更高的特異性和準確性。
使用方法：
一、樣品DNA的制備
用自選方法提取細菌樣品DNA。注意：DNA純化方法是決定檢測靈敏度的關鍵因素。如果不能很好純化樣品DNA，后面的PCR再靈敏也不能提高整體檢測靈敏度。
二、制備O157:H7標準曲線（以10-10E6這6個10倍稀釋度為例。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體病毒做陽性對照，只提供沒有傳染性的、可以直接使用的DN段作為陽性對照。
1. 標記6個離心管，分別為6，5，4，3，2和1號。
2. 用帶芯槍頭分別加入45 μL超純水（用帶芯槍頭，下同）。
3. 先將本試劑盒提供的陽性對照用TE緩沖液或超純水10倍梯度稀釋到10E7拷貝/μL（注：請不要將本試劑盒提供的標準品一次性稀釋至10E7拷貝/μL，建議每次稀釋10倍，梯度稀釋至10E7拷貝/μL）。
4. 在6號管中加入5 μL 10E7拷貝/μL的O157:H7陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得10E6拷貝/μL的陽性對照。
5. 換槍頭，從6號管中取5 μL溶液到5號管中，充分震蕩1分鐘，得10E5拷貝/μL的陽性對照。
6. 換槍頭，從5號管中取5 μL溶液到4號管中，重復上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照。
7. NC管中不加任何陽性對照。
8. 從1-6號管中分別取5 μL和待測樣品一起進行定量PCR（見下步），每個樣品做3次重復。PCR后得到每個陽性對照稀釋樣品的熒光PCR Ct值，并以之為縱軸，以濃度的對數值為橫軸，繪制標準曲線。
探針熒光定量PCR試劑盒原理分析如下圖：

應用案例：
樣品 DNA 的制備
1.用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數病毒 DNA 提取試劑盒兼 容。。也可以選購本公司的一管式病毒 DNAout 或其升級版柱式病毒 DNAout。 本試劑盒免費贈送 15 次 DNA 病毒裂解液試用裝（一管式病毒 DNAout 的成分）。
稀釋陽性對照（以 10E2-10E7 這 6 個 10 倍稀釋度為例。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的長為 86bp 的 DN段作為陽性對照。
2.標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
3.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。
4.在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩 1 分鐘，得1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。5.換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
6.換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5 號管中，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
7.換槍頭，在 4 號管中加 5 μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照到 4 號管中，得1×10E4 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用
8.重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。設置 qPCR 反應（20  μL 體系，在樣品制備室進行）
9.在 PCR 管中加入下列成分。
以下是公司正在銷售的產品：

2-苯基-2-惡唑啉細胞培養污染性支原體M.hominis鑒定16S rDNAPCR擴增檢測試盒

5-氨基-2,3-二吡啶細胞培養污染性支原體M.arginini鑒定16S rDNA PCR擴增檢測試盒

嗜衣原體通用探針法熒光定量PCR檢測試劑盒4-叔基芐細胞培養污染性支原體A.laidlawii鑒定16S rDNA PCR擴增檢測試盒

2-氟-5-硝基苯酸酯細胞培養抗支原體污染試盒

2,5-二基苯醚細胞脂質生成比色法定量檢測試盒

N-基-N-羥基苯胺地塞米松細胞脂肪誘導生成比色法定量檢測試盒

1-己基三氟烷磺酸吡啶鎓異基黃嘌呤細胞脂肪誘導生成比色法定量檢測試盒

1-基-3--4-氧羰基吡唑-5-磺酰胺胰島素細胞脂肪誘導生成比色法定量檢測試盒

1-基-2-硝基-4-(三氟苯)苯細胞脂質溶解比色法定量檢測試盒

2--4-氧基吡啶二苯細胞脂質溶解定性染色檢測試盒

三嗪環細胞脂質比色法定量檢測試盒

鄰氟二苯酮組織脂質比色法定量檢測試盒

L-2-氨基酰胺鹽酸鹽植物脂質比色法定量檢測試盒

2-氟-5-羥基苯醛脂肪肝比色法定量檢測試盒

2-羥基噻唑DMEM培養基AQP2  水通道蛋白-2抗體麥冬

AQP1/CHIP  水通道蛋白1抗體兩面針

AQP0/MIP26  水通道蛋白0抗體訶子

AP-TNAP/ALPL  堿性酸酶抗體青蒿

APS  APS抗體苦木

APRIN/PDS5B  雄激素誘導增殖抑制蛋白抗體苦玄參

APR3/C2orf28  凋亡相關蛋白3抗體苦參

APPL1  銜接因子蛋白含pH域酸酪氨酸結合域和亮氨酸拉鏈蛋白1抗體羅漢果

APPD/LAPF  凋亡誘導蛋白D抗體萎陵菜

APP695 (CT)  淀粉樣肽前體蛋白抗體（C端）珍珠（皺紋冠蚌）

APP/ABPP  淀粉樣肽前體蛋白抗體蓽茇

APP/ABPP  APP/ABPP淀粉樣肽前體蛋白抗體牽牛子

Apoptosis enhancing nuclease  細胞凋亡增強核酸酶抗體香加皮

Apollon/BIRC6  Apollon凋亡抑制蛋白抗體*味

APOL6  載脂蛋白樣蛋白6抗體穿山